葡萄糖-6-磷酸酶（G6P)試劑盒說(shuō)明書(shū)

分光光度法 50 管/48 樣

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

葡萄糖-6-磷酸酶（(glucose 6 phosphatase，G6Pase，EC 3.1.3.9）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和細(xì)胞中，是糖異生過(guò)程水解葡萄糖-6-磷酸生成葡萄糖的限制酶，在保證血糖的動(dòng)態(tài)平衡方面起著重要的作用。

測(cè)定原理：

G6P 催化葡萄糖-6-磷酸生成葡萄糖，變旋酶和葡萄糖脫氫酶進(jìn)一步依次催化NAD⁺還原生成NADH，在 340nm 下測(cè)定NADH 生成速率，即可反映 G6P 活性。

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組成：

自備儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 ml 石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的參數(shù)為準(zhǔn)

樣本前處理：

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ml 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

3、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、工作液的配制：臨用前將試劑二、試劑三和試劑四轉(zhuǎn)移到試劑一中混合溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

3、將工作液置于 37℃(哺乳動(dòng)物)或 25℃(其它物種)預(yù)熱 5 分鐘。

4、在 1ml 石英比色皿中加入 50μl 樣本和 950μl 工作液，立即混勻，記錄 340nm 處初始吸光值A1 和 2min后的吸光值A2，計(jì)算ΔA=A2-A1。

注意：在該試劑盒中，若ΔA 大于 0.3，需將樣本用提取液稀釋適當(dāng)倍數(shù)后測(cè)定，使ΔA 小于 0.3 可提高檢測(cè)靈敏度。計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。

G6P 活性計(jì)算：

1、血清（漿）G6P 活力計(jì)算

單位定義：每毫升血清（漿）每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

G6P（nmol/min/ml））＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷V 樣÷T=1608×ΔA 2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 G6P 活力計(jì)算

（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位定義：每mg 組織蛋白每分鐘生成 1nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

G6P（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T=1608×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計(jì)算

單位定義：每g 組織每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

G6P（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V 樣÷V 樣總)÷T=1608×ΔA÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

G6P（nmol/min/10⁴ cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=3.215×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，1×10^-3 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm； V 樣：加入樣本體積，0.05 ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，2 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬(wàn)。

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