miRNA Real-Time PCR Assay kit

miRNA 熒光定量 PCR 檢測試劑盒

miRNA熒光定量PCR檢測試劑盒（加尾法）

目錄號：71419

產(chǎn)品內(nèi)容

保存條件

-20℃保存，有效期 24 個月。

qPCR Mix 使用前，充分融解，輕柔顛倒混勻，短期使用可放在 4 ℃，避免反復(fù)凍融。

Reverse primer(10μM )每次用完置-20 ℃保存。

產(chǎn)品簡介

miRNA Real-Time PCR Assay kit 采用 SYBR Green I 嵌合染料法的原理進(jìn)行 miRNA 熒光定量檢測。

其中2x Universal miRNA SYBR Green qPCR Mix是專門為miRNA 定量檢測而研發(fā)的新一代2x預(yù)混液，包含除引物和 DNA 樣品以外的所有 qPCR 組分，可減少操作步驟，縮短加樣時間，降低污染幾率。其核心組分是全新的 Hotmaster Taq DNA 聚合酶，配合精心優(yōu)化的 Buffer 體系，有效抑制非特異性擴(kuò)增，可對寬廣濃度范圍的模板進(jìn)行準(zhǔn)確定量，獲得穩(wěn)定可靠的 qPCR 結(jié)果，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好等特點(diǎn)。

預(yù)混液中含有通用型ROX，適用于所有qPCR儀，使用qPCR Mix時不需要額外添加ROX來校正儀器。

注意：該試劑盒需要與增強(qiáng)型miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒（加尾法）（Cat# P418-25）配套使用。

1. 需要自備的試劑：待檢測miRNA對應(yīng)的qPCR上游引物（Forward primer）

2. 待檢測miRNA對應(yīng)的qPCR上游引物（Forward primer）

Forward Primer設(shè)計(jì)原則：

1. 遵循引物設(shè)計(jì)的zui普遍原則。

2. 以成熟的miRNA 序列為基礎(chǔ)，將U 替換成T，這是最基礎(chǔ)和zui簡單的設(shè)計(jì)方法。

3. 試劑盒中提供的下游引物的Tm 值為65℃，設(shè)計(jì)上游引物的Tm 值要盡量保證在65℃左右。

4. 若按照原則2 的方式直接設(shè)計(jì)的引物其Tm 值過低，可以在引物的5’端添加幾個堿基（最好為G 或C 堿基）；也可以在3’端添加1 個或幾個A 堿基；或者5’端和3’端同時修飾。

5. 若按照原則2 的方式直接設(shè)計(jì)的引物其Tm 值過高，可以在引物的5’或3’端去掉幾個堿基。

操作步驟：

1. 將DNA模板、引物、2x Universal miRNA SYBR Green qPCR Mix、RNase-Free H2O溶解并置冰上備用。

2. 使用時請將2 x miRNA qPCR Mix上下顛倒輕輕均勻混合，避免起泡，并經(jīng)輕微離心后使用。

3. 冰上配制qPCR反應(yīng)體系：（以20μl反應(yīng)體系為例）

1） 推薦模板加樣量為1-2μl / 20μl反應(yīng)體系，miRNA 第一鏈cDNA不應(yīng)超過總反應(yīng)體系的10%，對于特殊的檢測體系中，高含量的cDNA 模板易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增，根據(jù)所檢測miRNA 的豐度適當(dāng)?shù)南♂?/span>cDNA（10倍或者100倍）。

2） 本品中含有熒光染料Sybr Green I，保存本品或配制PCR反應(yīng)液時應(yīng)避免強(qiáng)光照射。

3） 通常推薦引物濃度為0.2 μM，就可以得到較好的結(jié)果，反應(yīng)效果不佳時可在0.1 - 1.0 μM范圍內(nèi)進(jìn)行調(diào)整。擴(kuò)增效率不高的情況下，可提高引物濃度；發(fā)生非特異性反應(yīng)時，可降低引物濃度，由此優(yōu)化反應(yīng)體系。

4. qPCR反應(yīng)程序

注意：

1） 絕大多數(shù)情況下，使用二步法或三步法均可獲得良好效果。二步法擴(kuò)增特異性高，三步法擴(kuò)增效率高。如果融鏈曲線較差，可以嘗試兩步法擴(kuò)增或提高退火溫度；如果因使用Tm值較低的引物等原因，得不到良好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果時，可嘗試加長延伸時間或者進(jìn)行三步法PCR擴(kuò)增。

2） 根據(jù)引物的Tm值進(jìn)行退火&延伸（退火）溫度的設(shè)定；

3） 延伸（退火&延伸）時間的設(shè)置還需要根據(jù)您所使用的qPCR儀所需要的最短數(shù)據(jù)采集時間自行調(diào)整。

4） 融解曲線分析請以所使用的熒光定量PCR儀推薦的程序進(jìn)行設(shè)定。

miRNA熒光定量PCR檢測試劑盒（加尾法）